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La pared celular de las bacterias GRAM Positivas
está constituida principalmente por peptidoglucano y ácidos teicoicos; en los
GRAM Negativos, por capas de peptidoglucano, lipoproteínas, lipopolisacáridos y
la membrana externa.
Los colorantes son productos químicos sintéticos, que existen en formas de sales químicas, con capacidad para disociarse en iones (con cargas positivas y negativas) y nos permiten hacer más visibles los microorganismos, estudiar su estructura, revelar su naturaleza química y conocer la etapa de su desarrollo.
Los colorantes ácidos se caracterizan por tener
el radical ácido coloreado y el radical básico incoloro: tiñen el protoplasma
de la célula. Ejm: la eosina, fucsina ácida, azul de anilina y fluoresceína.
Los colorantes básicos consisten en un catión
coloreado unido a un anión incoloro: tiñen el núcleo de la célula. Ejm: azul de
metileno, violeta de genciana, fucsina básica, safranina.
Las células bacterianas son ricas en ácido
nucleico los cuales portan cargas negativas en forma de grupos fosfatos; estos
se combinan con los colorantes básicos cargados positivamente, por lo que son
los más usados en citología bacteriana. Los colorantes ácidos no tiñen la
célula bacteriana y por lo tanto pueden ser usados para impartir al fondo un
color de contraste.
COLORACIÓN GRAM: Se ha estudiado mucho desde su iniciador (Hans
Christian Gram, en 1884) hasta nuestros días, el mecanismo íntimo de la
coloración GRAM, surgiendo varias teorías al respecto.
La más generalizada es que el complejo
cristal-violeta-yodo al ser tratado con el alcohol acetona, la bacteria no cede
el colorante quedando teñida violeta. En cambio las que ceden el colorante por
el tratamiento con el alcohol-acetona, quedan incoloras pero luego se tiñen con
el colorante de contraste (fucsina básica o safranina), y pueden ser
observadas.
Recientes estudios comparativos atribuyen el
carácter de GRAM positividad a la estructura química de las paredes celulares;
entre otras, principalmente al contenido de lípidos.
En las Gram positivas la permeabilidad de las
paredes puede decrecer por el efecto deshidratante del alcohol, mientras que en
las Gram negativas al alcohol extrae de sus paredes el alto contenido en
lípidos, aumentando la permeabilidad. De esta manera, fácilmente escapa el
complejo cristal violeta-yodo o violeta de O genciana-yodo.
• Bacterias GRAM POSITIVAS: Toman el colorante cristal violeta, tiñéndose de azul violáceo.
• Bacterias GRAM NEGATIVAS: Pierden el cristal violeta al ser decolorada con alcohol-acetona, se
tiñen con el colorante de contraste: safranina, para ser observadas de color
rojo.
MATERIALES:
•
Tubos con cultivos bacterianos en medio sólido y líquido.
•
Batería de colorantes para coloración Gram.
•
Láminas portaobjetos, asa de platino.
•
Suero fisiológico, mechero.
PROCEDIMIENTO:
•
Preparar un frotis en lámina portaobjeto
•
Dejar secar y luego fijarla al calor.
•
Cubrir el frotis con unas gotas de Violeta de genciana.
•
Luego de un minuto lavar la lámina con agua.
•
Cubrir el frotis con solución de lugol por 1 minuto, luego lavar.
•
Decolorar con alcohol acetona, gota a gota, hasta hacer desaparecer el
colorante violeta genciana, a partir del borde de la lámina y no directamente
sobre el frotis.
•
Cubrir con solución de Fucsina básica de 10 a 20 seg.
•
Lavar con agua. Dejar secar la lámina.
•
Observar al microscopio con objetivo de inmersión (100x)
•
Llenar el protocolo.
PREGUNTAS DE EVALUACIÓN:
1. Señale las diferencias entre la pared celular de las bacterias Gram
Positivas y Negativas.
2. En que consiste la coloración gram modificada por Kopeloff.
3. Los colorantes especiales permiten la observación de diversos componentes
bacterianos (gránulos de volutina, cápsula, espora, flagelos,etc). Señale que
componente bacteriano puede observarse con las siguientes coloraciones: Albert,
Hiss , Wirtz Conklin.
