Diagnostico Inmunológico: Reacción Inmunoenzimática.

PRINCIPIOS GENERALES

❖ Para hacer el diagnostico de infección por VIH, se emplean pruebas para un diagnostico preliminar (tamizaje) y confirmatorias, que detectan anticuerpos en muestras de sueros.

❖ Las pruebas inmunológica ligadas a enzimas (ELISA) se usan para un diagnostico preliminar basado en la detección, de los anticuerpos contra VIH.

❖ El suero o plasma son los elementos más comunes usados para la detección de anticuerpos. Deben guardarse congelados en el caso de que la prueba no pueda realizarse inmediatamente luego de la recolección.

❖ Los procedimientos más comúnmente usados se clasifican como pruebas de ELISA indirecto, competitivo y de captura.

❖ Los antígenos usados en estas pruebas pueden ser derivados de virus lisados o producidos por recombinación genética y sintéticamente.

❖ Los anticuerpos son producidos en animales y pueden ser monoclonales o policlonales.

❖ Estos reactivos se incluyen en los paquetes (kits) de las pruebas comerciales, ya sea fijados o fase sólida o empaquetados separadamente junto con otros reactivos.

❖ Todos los juegos de las pruebas incluyen especímenes de control positivo y negativo que deben ser incluidos durante cada examen para asegurar la validez de los resultados de la prueba.

PRUEBA DE ELISA INDIRECTA
FUNDAMENTO

❖ La muestra de suero se diluye en el soporte en el que se encuentra inmovilizado el antígeno. Se incuba por un período especifico de tiempo y a una temperatura exacta de acuerdo a las instrucciones de fabricante.

❖ Si las muestras de suero contienen los anticuerpos específicos, estos formaran un complejo antigeno - anticuerpo y permanecerán unidos al soporte. La muestra de suero se elimina por lavado

❖ Luego, agregar anticuerpos antiinmunoglobulinas totales humanas conjugadas con Peroxidasa. Incubar a la temperatura indicada por el fabricante.

❖ Este conjugado se unirá al complejo antígeno - anticuerpo, si esto último se produjo en el paso 2 del proceso.

❖ Realizar un nuevo lavado y agregar el substrato enzimático.

❖ En los casos en que se haya unido el conjugado, la reacción genera un producto coloreado proporcional ala concertación de anticuerpos de la muestra.

❖ La concentración de anticuerpos es detectada por el espectrofotómetro a una longitud de onda determinada según los procedimiento del fabricante.

❖ La lectura de resultados positivos se basa en la aparición de un color que se pude detectar ya sea visualmente o con un espectrofotómetro.

❖ Es la prueba más usada.

PRUEBA DE ELISA COMPETITIVO

FUNDAMENTO

❖ Es un método indirecto modificado para detectar anticuerpos VIH

❖ El anticuerpo VIH es la muestra positiva compite con el anticuerpo VIH marcado con la enzima por los lugares reactivos en los antígenos ligados al soporte de fase sólida.

❖ Por lo tanto, ambos, la muestra y el anticuerpo marcado con la enzima son añadidos al mismo tiempo.

❖ El anticuerpo de la muestra positiva se ligara al antígeno  y por lo tanto evitara que los anticuerpos marcados con enzima se junten con el antígeno.

❖ Esto limitara la cantidad de enzima disponible para reaccionar con el substrato y no se producirá ningún color para casos de muestras positivas con anticuerpos a VIH.

❖ En contraste, las muestras que son negativas para anticuerpos a VIH permitirá a la gran mayoría de los anticuerpos marcados con enzima ligarse al antígeno fijado al soporte.

❖ Al agregar el substrato de la enzima resultara en el desarrollo de un color similar al control negativo.

PRUEBA DE ELISA CON ANTÍGENO DE CAPTURA
FUNDAMENTO

❖ Esta prueba puede ser realizada como una prueba indirecta o competitiva.

❖ Un anticuerpo monoclonal (específico para un determinante antigénico) es ligado a la fase sólida.

❖ Un reactivo con el antígeno especifico del VIH se añade enseguida a la ase sólida con el fin de que el antígeno se ligue al anticuerpo monoclonal.

PROCEDIMIENTO

1. Después de un período de incubación y de lavado, el suero que se va a examinar es añadido e incubado.

2. la fase sólida es luego lavada y se añade la inmunoglobulina anti-lg humana marcada con la enzima, se incuba y se lava.

3. Añadir el substrato de la enzima, mezclar e incubar.

4. Si es positiva, es la muestra de suero se produce color.

PREGUNTAS DE EVALUACIÓN:

1. ¿Cuál de los métodos de ELISA es más conveniente?

2. ¿Qué es un periodo de ventana?

3. ¿Qué es la prueba de WesternBlot?

4. ¿Qué se puede determinar con la prueba de ELISA?