Métodos Serológicos en el Diagnóstico de Salmonelosis


PRINCIPIOS GENERALES
  • La serología del género Salmonella constituye el complemento necesario para el diagnóstico de la fiebre tifoidea.
  • El género Salmonella tiene principalmente dos clases de antígenos.
    • El antígeno “O” o antígeno somático termoestable.
    • El antígeno “H” o antígeno flagelar termolábil.
  • A partir de la segunda semana, el paciente que sufre de fiebre tifoidea, contiene anticuerpos en la sangre, que pueden ser identificados probando el suero del paciente contra antígenos de Salmonellas, los cuales pueden ser demostrados por la reacción de Widal.
  • La reacción de Widal incluye:
    • Aglutinación en placa
      • Procedimiento ampliamente utilizado por su simplicidad.
    • Aglutinación en tubo
      • Debe utilizarse para confirmar la presencia de anticuerpos demostrados por la prueba en placa y para cuantificar su título.

 AGLUTINACIÓN EN PLACA
  • Se encuentra en el comercio antígeno de O y H de Salmonella para realizar la prueba. Este método es rápido y exacto.
  • Es preciso agitar bien el vial de antígeno, antes de usarlo, para garantizar una suspensión uniforme y lisa. No deben congelarse.
  • Almacenar los viales con antígeno a 2 -8 °C.

MATERIALES
  • Antígeno de Salmonella typhi H y O
  • Materiales para obtención de suero del paciente
  • Pipetas serológicas de 0,2 mi
  • Placa de vidrio grande (20 x 20 cm) dividida con lápiz de cera y regla en cuadrados (2.5 - 1.7 cm) de preferencia, 5 hileras de 6 cuadrados.
  • Un aplicador o un palito de dientes.

MÉTODO

1. Depositar en los cuadrados de cada hilera o en cada lámina las siguientes medidas del suero del paciente: 0,08; 0,04; 0,02; 0,01 y 0,005 ml.
2. Añadir a cada medida del suero 0,03 ml de suspensión de antígeno.
3. Mezclar cada compuesto antígeno suero con un aplicador o un palito de dientes, comenzar con la dilución de suero de 0,005 ml y continuar hasta la dilución de 0,08 mi
4. Rotar (oscilar) la placa de vidrio suavemente 15-20 veces (durante 2 minutos). Proceder a la lectura inmediatamente.

LECTURA E INFORME

1. Observar la presencia de grumos, indicativo de aglutinación.
2. Los grados de aglutinación se interpreta con la siguiente escala:

4+
 Aglutinación completa
3+
 El 75% de las partículas, están aglutinadas
2+
El 50% de las partículas, están aglutinadas
1 +
 El 25% de las partículas, están aglutinadas
Negativo
 Ninguna aglutinación

3. Las diluciones de suero sobre la placa alas siguientes diluciones en tubo (aglutinación en tubo):
  • 0,08 ml de suero 1/20
  • 0,04 ml de suero 1/40
  • 0,02 ml de suero 1/80
  • 0,01 ml de suero 1/160
  • 0,005 ml de suero 1/320
4. Título del suero
El título del suero que se informa corresponde a la última dilución del suero en que se produce una aglutinación de por lo menos 2+ (50%).

5. Ejemplo de cálculos

Placa 1 Placa 2 Placa 3 Placa 4 Placa 5 Resultados
Dilución 0,08 ml Dilución 0,04 ml Dilución 0,02 ml Dilución 0,01 ml Dilución 0,005 ml
2+
1+
-
-
-
Positivo 1/20
3+
2+
1+
-
-
Positivo 1/40
4+
3+
2+
1+
-
Positivo 1/80
4+
4+
3+
2+
1+
Positivo 1/160
4+
4+
4+
3+
2+
Positivo 1/320

AGLUTINACIÓN EN TUBO

  • En esta prueba, el suero del paciente se diluye de manera seriada en tubos de ensayo.

MATERIALES

  • Obtención del suero del paciente.
  • Cloruro de sodio al 0,85% formalizado (0, 5 ml de formaldehído por 100 ml de solución salina).
  • Antígeno de Salmonella O ó H
  • Tubos de 12 x 75 mm de fondo redondo
  • Gradillas
  • Pipetas serológicas de 1 ml y 5ml
  • Baño maría
  • Fuente de luz adecuada.

MÉTODO

1. Colocar 8 tubos enumerados en una gradilla para cada suero a probar
2. Con la pipeta medir 0,9 ml de cloruro
3. Con la pipeta medir 0,05 ml de cloruro de sodio al 0,85% y depositarlo en cada uno de los tubos restantes (tubo 2 al tubo 8)
4. Agregar 0,1 ml del suero del paciente al tubo 1
5. Mezclar bien el tubo 1
6. Transferir 0,5 ml del 1 al tubo 2. Mezclar a fondo.
7. Seguir llevando 0,5 ml del tubo 2 al tubo 3 y así sucesivamente hasta el tubo
7. desechar los 0,5 ml del tubo 7 después de mezclar a fondo.
8. El tubo 8 es el tubo de control del antígeno
9. Añadir 0,5ml del antígeno (Salmonella O ó H) a cada uno de los 8 tubos
10. Agitar cada uno de los tubos para mezclar el antígeno y el suero.
11. Poner los tubos en un baño maría de acuerdo con lo siguiente:

  • Antígeno de Salmonella O, de 16 - 18 horas a 50°C
  • Antígeno de Salmonella H, 1 hora a 50°C
Es importante en esta prueba usar el tiempo y la temperatura recomendada y asegurarse que el baño maría está en un lugar librea de vibraciones mecánicas.
12. Las diluciones resultantes van desde 1/20 hasta 1/1 280, respectivamente.

LECTURA E INFORME
1. Utilizando una lámpara fluorescente contra un fondo negro, registrar el grado de aglutinación de la siguiente forma:

4+ El 100% de las partículas están aglutinadas y el líquido sobrenadante es transparente.
3+ El 75% de las partículas están aglutinadas y el líquido sobrenadante está ligeramente turbio.
2+ El 50% de las partículas están aglutinadas y el líquido sobrenadante está moderadamente turbio
1+ El 25% de las partículas están aglutinadas y el líquido sobrenadante está turbio.
Negativo No es visible ninguna aglutinación y las partículas permanecen como una suspensión turbia. Esta reacción debe observarse en el tubo 8

2. La aglutinación de los antígenos (“O”, “H”) tiene las siguientes características:
  • Antígeno somático “O”
    • Se caracteriza por una aglutinación compacta, gruesa, la cual tiende a ser difícil de dispersar.
  • Antígeno flagelar “H”
    • Tiene una aglutinación floculante y fina. Debe tenerse cuidado de no agitar una reacción de antígeno “H” demasiado, mientras se examina.
3. Título del suero
El título del suero que se informa corresponde a la última dilución del suero en que se produce una aglutinación de por lo menos2+ (50%).

4. Se recomienda que 1/160 de título para el antígeno “O” es diagnóstico de Fiebre Tifoidea, pero es todavía más importante demostrar que este título va aumentado en pruebas sucesivas 1 -2 semanas después.

5. Ejemplo de cálculos:

Tubo 1
Tubo 2
Tubo 3
Tubo 4
Tubo 5
Tubo 6
Tubo 7
Resultados
Dilución 1/20
Dilución 1/40
Dilución 1/80
Dilución 1/80
Dilución 1/320
Diución 1/640
Dilución 1/1280
2+
1+
-
-
-
-
-
Positivo 1/20
3+
2+
1+
-
-
-
-
Positivo 1/40
4+
3+
2+
1+
-
-
-
Positivo 1/80
4+
4+
3+
2+
1+
-
-
Positivo 1/160
4+
4+
4+
3+
2+
1+
-
Positivo 1/320
4+
4+
4+
4+
3+
2+
1+
Positivo 1/640
4+
4+
4+
4+
4+
3+
2+
Positivo 1/1280

PREGUNTAS DE EVALUACIÓN:

1. ¿Cuándo se considera que una persona tiene tifoidea?
2. ¿Quiénes están más predispuestas a esta enfermedad?
3. ¿Definir los diferentes antígenos de las Salmonellas?



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